現代中，分離效果好壞的一個(ge) 重要指標是色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇範圍很寬，因此，要做合適的選擇，必須對此有一定的認識和了解。
    一、矽膠基質填料 
    1、。正相色譜用的固定相通常為(wei) 矽膠（Silica）以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。
    由於(yu) 矽膠表麵的矽羥基（SiOH）或其他極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份zui先被衝(chong) 洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
    2、。反向色譜用的填料常是以矽膠為(wei) 基質，表麵鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為(wei) 水、緩衝(chong) 液與(yu) 甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分zui先被衝(chong) 洗出，而極性弱的組分會(hui) 在色譜柱上有更強的保留。
    常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
    二、聚合物填料。聚合物填料多為(wei) 聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優(you) 點是在PH值為(wei) 1—14均可使用。相對於(yu) 矽膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物對蛋白質等樣品的分離非常有效。現有的聚合物填料的缺點是相對矽膠基質填料，色譜柱柱效較低。
    三、其它無機填料。其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化由於(yu) 其特殊的性質，一般於(yu) 特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為(wei) 反向色譜柱填料。這種填料的分離不同於(yu) 矽膠基質烷基鍵合相，石墨化碳的表麵即是保留的基礎，不再需其它的表麵改性。該柱填料一般比烷基鍵合相矽膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用於(yu) 分離某些幾何異構體(ti) ，由於(yu) 在HPLC流動相中不會(hui) 被溶解，這類柱可在任何PH與(yu) 溫度下使用。氧化鋁也可以用於(yu) HPLC。氧化鋁微粒剛性強，可製成穩定的色譜柱柱床，其優(you) 點是可以在PH高達12的流動相中使用。但由於(yu) 氧化鋁與(yu) 堿性化合物的作用也很強，應用範圍受到一定限製，所以未能廣泛應用。新型色譜氧化鋯基質填料也可用於(yu) HPLC。商品化的隻有聚合物塗層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用PH1-14，溫度可達100℃。由於(yu) 氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究，加之麵臨(lin) 的實驗難度，其重要用途與(yu) 優(you) 勢尚在進行之中。
    怎樣選擇填料粒度。目前，商品化的色譜填料粒度從(cong) 1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5um填料進行。填料的粒度主要影響填充柱的兩(liang) 個(ge) 參數，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限製了粒度小於(yu) 3um的填料應用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是*的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那麽(me) 選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與(yu) 此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數或分離能力，但是柱長更短，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。 

維護 
（1）防止色譜柱堵塞 
原因1：溶劑中的不溶物 
 — 應使用色譜純溶劑，膜過濾（孔徑不超過0.45μm） 
原因2：樣品中的不溶物 
 — 應對樣品進行膜過濾（孔徑不超過0.45μm） 
原因3：泵，進樣器等中的不溶物 
—  在泵和進樣器之間安裝內(nei) 置過濾器，在進樣器和柱之間安裝預過濾器 
原因4：柱內(nei) 不溶物的形成 
4-1．由於(yu) 溶劑的不互溶而產(chan) 生的沉澱 
—用能溶解沉澱物的溶劑衝(chong) 洗色譜柱 
4-2．在不互溶溶劑中由於(yu) 進樣而產(chan) 生的沉澱 
    —檢查樣品液和流動相是否互溶 
4-3．由於(yu) 溫度的改變或固定相的幹涸而產(chan) 生的沉澱 
—將密封緊，並保持室溫恒定 
操作壓力上升故障排除 
HPLC係統流程圖： 
吸入過濾器>>泵>>內(nei) 置過濾器>>進樣器>>預過濾器>>保護柱>>主分析柱>>檢測器 
和排放係統 
從(cong) 流程圖的末端依次斷開部件，如從(cong) 檢測器開始斷開，zui容易引起阻塞的部件是： 
預過濾器，保護柱和主分析柱 。
[注]：應記錄新柱子在常規分析條件下的操作壓力 
（2）柱堵塞的修複 
步驟1：使用含鹽緩衝(chong) 液後（如離子對試劑）應用溶解性強的溶劑（如水）進行衝(chong)  
洗 ；
步驟2：先斷開檢測器，然後用對來自樣品中的物質有強溶解性的溶劑進行衝(chong) 洗。 
對於(yu) 反相，可使用甲醇，乙睛，四氫呋喃，氯仿，庚烷等，在此條件下，應 
避免溶劑的pH低於(yu) 2或高於(yu) 8；
若經過步驟1和步驟2後，壓力仍沒下降至步驟3 ；
步驟3：斷開檢測器，將色譜柱反方向放置，然後檢查柱壓 
1）若壓力穩定下降，至步驟4 

2）若壓力不下降，至步驟5 
步驟4：保持色譜柱反方向連接，用低於(yu) 0.5 ml/min 流速衝(chong) 洗1小時 
若步驟4不能降壓，至步驟5 ；
步驟5：若內(nei) 置過濾器被堵塞，應衝(chong) 洗或更換。柱連接端的拆卸或重裝會(hui) 導致柱效 
下降，（有效塔板數下降和不對稱峰），若步驟5不能降低柱壓，至步驟6 
步驟6：若進口端的填料發生堵塞，柱子將不可能被*恢複，隻能通過去掉進口 
端的部分填料，重新填充進行有限的柱效恢複。（2~5mm） ；
[注]：在多數情況下，柱效將嚴(yan) 重地下降 
步驟7：若步驟6無法改善柱子性能，那麽(me) 柱子已無法修複，請注意當拆開連接端時 
柱子已不再得到質量保證。 
柱效的下降：
導致柱有效塔板數和分離能力下降的主要原因是固定相的惡化和矽膠表麵活性鏈的 
損失，在這些條件下柱子已不可能再恢複

的使用

1、色譜柱的使用說明： 
　　（1）色譜柱使用前注意事項：色譜柱的儲(chu) 存液無特殊說明，均為(wei) 評價(jia) 報告所示的流動相。在使用前，一定要注意色譜柱的儲(chu) 存液與(yu) 要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩衝(chong) 液作洗脫劑，應先用10％左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩衝(chong) 液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出，堵塞色譜柱。
　　（2）流動相：流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動相再經過0.45μm的濾膜過濾一次則zui好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜係統中的在線過濾器等裝置應該定期清洗或更換。
　　以常規矽膠為(wei) 基質的鍵合相填料通常的PH值適用範圍是2.0-8.0，BDS C18適合於(yu) 堿性化合物，PH值適用範圍為(wei) 2.0-10.0。當必須要在PH值適用範圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結束後立即用適合於(yu) 色譜柱儲(chu) 存並與(yu) 所使用的流動相互溶的溶劑清洗，並*置換掉原來所使用的流動相。
　　（3）樣品：樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預處理柱（SPE）對樣品進行預處理；若樣品不便處理，要使用保護柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應嚴(yan) 格脫水。
　　2、的保存 
　　（1）反相色譜柱每天實驗後的保養(yang) ：使用緩衝(chong) 液或含鹽的流動相，實驗完成後應用10%的甲醇/水衝(chong) 洗30分鍾，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇衝(chong) 洗30分鍾。注意：不能用純水衝(chong) 洗柱子，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料衝(chong) 塌陷。
　　（2）長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存，必須存於(yu) 合適的溶劑下。對於(yu) 反相柱可以儲(chu) 存於(yu) 純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲(chu) 存於(yu) 嚴(yan) 格脫水後的純正己烷中，離子交換柱可以儲(chu) 存於(yu) 水（含防腐劑*或柳硫汞）中，並將購買(mai) 新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲(chu) 存的溫度是室溫。
　　3、的再生 
　　因為(wei) 色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數的增加，會(hui) 出現色譜峰高降低，峰寬加大或出現肩峰的現象，一般來說可能是柱效下降。
　　（1）反相柱的再生：依次采用20-30倍的色譜柱體(ti) 積的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，異丙醇作為(wei) 流動相衝(chong) 洗色譜柱，完成後再以相反順序衝(chong) 洗色譜柱。
　　（2）正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體(ti) 積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為(wei) 流動相衝(chong) 洗，然後再以相反的順序衝(chong) 洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yan) 格脫水。
　　4、在使用過程中易出現的問題和解決(jue) 辦法 
　　色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬於(yu) 正常現象。但柱壓在使用過程中突然升高（係統管路堵塞及壓力傳(chuan) 感器故障除外），以下列舉(ju) 了部分常見原因及解決(jue) 辦法：
　　（1）色譜柱頭的過濾篩板堵塞或汙染；
　　解決(jue) 方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被汙染，可以將色譜柱反方向用甲醇衝(chong) 洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內(nei) 超聲清洗10分鍾，後再用純水超聲10分鍾，重新裝入色譜柱。
　　（2）色譜柱頭的填料被樣品汙染；
　　解決(jue) 方法：如確定色譜柱頭的填料被汙染，將柱頭螺絲(si) 卸下，挖出柱內(nei) 前段被汙染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修複後，重新安裝上柱頭螺絲(si) 。
　　（3）色譜柱內(nei) 緩衝(chong) 液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶析出； 解決(jue) 方法：如確定定是鹽結晶，用10%的甲醇/水衝(chong) 洗色譜柱使柱內(nei) 鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。
　　（4）流動相PH值過大或過小使固定相結構破壞或溶解。解決(jue) 方法：如果因PH值使用不當，很難恢複 液相色譜儀(yi) 由高壓液體(ti) 泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guan) 鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數據的必經之路。
　　一、的安裝：
　　1、液相色譜柱的結構：
　　a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
　　柱接頭采用低死體(ti) 積結構，柱接頭是兩(liang) 端螺紋組件，一端是為(wei) 7/16英寸外螺紋，另一端是3/16英寸的內(nei) 螺紋(國內(nei) 外已規範化)。7/16英寸外螺紋與(yu) 1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接，中間放置壓壞用於(yu) 密封。3/16英寸的內(nei) 螺紋與(yu) 1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接，中間也放置壓環用於(yu) 柱接頭的密封。為(wei) 了盡量減少柱外死體(ti) 積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環後要盡量插到底，然後再擰緊空心螺釘。壓環被空心螺釘擠壓變形後緊箍在連接管上(連接管通過壓環後露出的管長度應嚴(yan) 格控製在2．5mm長或其他固定尺寸)。
　　在兩(liang) 端柱接頭內(nei) ，柱管兩(liang) 端各放置一片不鏽鋼濾片(或濾網)，用於(yu) 封堵柱填料不被流動相衝(chong) 出柱外而流失。空柱各組件均為(wei) 316#不鏽鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由於(yu) 含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nei) 不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
　　b、柱填料：
　　液相色譜柱的分離作用是在填料與(yu) 流動相之間進行的，柱子的分類是依據填料類型而定。
　　正相柱：多以矽膠為(wei) 柱填料。根據外型可分無定型和球型兩(liang) 種，其顆粒直徑在3—10
μm的範圍內(nei) 。另一類正相填料是矽膠表麵鍵合—CN，-NH2等官能團即所謂的鍵合相矽膠。
　　反相柱：主要是以矽膠為(wei) 基質，在其表麵鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
　　常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。
　　2、色譜柱的安裝：
　　a、拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nei) 貯存的溶劑。
　　b、擰下柱兩(liang) 端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
　　c、 按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與(yu) 進樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護柱)；柱的出口與(yu) 檢測器連接。連接管是外徑為(wei) 1.57mm、內(nei) 徑為(wei) 0.1-0.3mm的不鏽鋼管。連接管的兩(liang) 端均有空心螺釘及密封用壓環。在接管時一定要設法降低柱外死體(ti) 積。連接管通過空心螺釘、壓環後盡量用力插到底，然後順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為(wei) 止，再用扳手繼續順時針擰1/4-1/2圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓後有漏液現象，請用扳手繼續順時針擰1/4圈，直至不漏液為(wei) 止。
　　二、的使用：
　　色譜柱在使用前，進行柱的性能測試，並將結果保存起來，作為(wei) 今後評價(jia) 柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由於(yu) 所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是*條件)，隻有這樣，測得的結果才有可比性。
　　1、樣品的前處理：
　　a、使用流動相溶解樣品。
　　b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與(yu) 柱填料產(chan) 生不可逆吸附的雜質。
　　c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
　　2、流動相的配製：
　　是樣品組分在柱填料與(yu) 流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
　　a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(hui) 沉澱在柱中(或長時間保留在柱中)。
　　b、流動相具有一定惰性，與(yu) 樣品不產(chan) 生化學反應(特殊情況除外)。
　　c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體(ti) 泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
　　d、流動相的物化性質要與(yu) 使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配製。
　　e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chan) 生氣泡，導致實驗無法進行。
　　f、在流動相配製好後，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體(ti) 既有利於(yu) 檢測，還可以防止流動相中的微量氧與(yu) 樣品發生作用。
　　3、流動相流速的選擇：
　　因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對於(yu) 一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對內(nei) 徑為(wei) 4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對於(yu) 內(nei) 徑為(wei) 4.0mm柱，流速0.8ml/min為(wei) 佳。
　　當選用*流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。
　　注意：
　　a．由於(yu) 甲醇廉價(jia) ，對於(yu) 反相柱推薦使用甲醇體(ti) 係(必須使用乙腈的場合除外)。
　　b．對於(yu) 正相柱推薦使用沸程為(wei) 30-60℃的石油醚或提純後的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大於(yu) 18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果。
　　c．含水流動相zui奸在實驗前配製，尤其是夏天使用緩衝(chong) 溶液作為(wei) 流動相不要隔夜。加入*，防止細菌生長。
　　d．流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除去微粒雜質。
　　e．使用HPLC級溶劑配製流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
　　4、柱性能測試：
　　啟動液相色譜儀(yi) ：a、流動相流速設定為(wei) 1ml/min。
　　b、UV檢測器波長設定為(wei) 254nm。
　　使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。
　　記錄並計算測試結果。

2、的保存 

（1）反相色譜柱每天實驗後的保養(yang) ：

使用緩衝(chong) 液或含鹽的流動相，實驗完成後應用10%的甲醇/水衝(chong) 洗30分鍾，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇衝(chong) 洗30分鍾。注意：不能用純水衝(chong) 洗柱子，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料衝(chong) 塌陷。

（2）長期保存色譜柱：

如色譜柱要長時間保存，必須存於(yu) 合適的溶劑下。對於(yu) 反相柱可以儲(chu) 存於(yu) 純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲(chu) 存於(yu) 嚴(yan) 格脫水後的純正己烷中，離子交換柱可以儲(chu) 存於(yu) 水（含防腐劑*或柳硫汞）中，並將購買(mai) 新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲(chu) 存的溫度是室溫。

3、色譜柱的再生  

因為(wei) 色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數的增加，會(hui) 出現色譜峰高降低，峰寬加大或出現肩峰的現象，一般來說可能是柱效下降。

（1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色譜柱體(ti) 積的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，異丙醇作為(wei) 流動相衝(chong) 洗色譜柱，完成後再以相反順序衝(chong) 洗色譜柱。

（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體(ti) 積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為(wei) 流動相衝(chong) 洗色譜柱，然後再以相反的順序衝(chong) 洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yan) 格脫水。

4、色譜柱在使用過程中易出現的問題和解決(jue) 辦法 

色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬於(yu) 正常現象。但柱壓在使用過程中突然升高（係統管路堵塞及壓力傳(chuan) 感器故障除外），可能的原因有如下幾點：

（1）色譜柱頭的過濾篩板堵塞或汙染；

（2）色譜柱頭的填料被樣品汙染；

（3）色譜柱內(nei) 緩衝(chong) 液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶析出；

（4）流動相PH值過大或過小使固定相結構破壞或溶解。

解決(jue) 辦法如下：

（1）如確定是色譜柱頭的過濾篩板被汙染，可以將色譜柱反方向用甲醇衝(chong) 洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內(nei) 超聲清洗10分鍾，後再用純水超聲10分鍾，重新裝入色譜柱。

（2）如確定色譜柱頭的填料被汙染，將柱頭螺絲(si) 卸下，挖出柱內(nei) 前段被汙染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修複後，重新安裝上柱頭螺絲(si) 。

（3）如確定定是鹽結晶，用10%的甲醇/水衝(chong) 洗色譜柱使柱內(nei) 鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。

（4）如果因PH值使用不當，很難恢複。